利用氣相層析法(Gas chromatography,GC)測定醱酵過程中醱酵液所含乙醇濃度之步驟如下:
- 選擇氣相層析系統(Gas Chromatography,GC)
氣相層析系統必須配備完整之管端注射器和相關配件,包括火燄離子偵測器(Flame ionization detector,FID)、管柱組件、記錄器、氣體和注射針等,並有數據處理系統以量測尖峰面積或高度。
- 檢液之製備(Preparation of sample)
- 取醱酵漿狀物(Fermentation slurry)經離心分離(6000 rpm,5 min)後,以具0.45 µm濾片(Filter)之注射器(Syringe)過濾取出上清液(Supernatant)。
- 於濾出之上清液中加入內標準品溶液,作為檢液。
- 檢液含有0.9 g/L之內標準品溶液,且乙醇濃度應落在檢量線範圍內。
- 氣相層析系統之準備(Preparation of GC)
- 內標準品溶液之製備(Preparation of Internal standard spiking solution) :利用異丙醇(Isopropanol)製備內標準品溶液(Internal standard spiking solution),以相同之比例分別加入乙醇操作標準溶液、檢液。
- 乙醇操作標準溶液與檢量線之製備(Preparation of Ethanol working standards solution and calibration line):利用200 proof ethanol配置3~6份,分別含有0.9 g/L內標準品溶液之0.1 g/L~5.0 g/L之乙醇操作標準溶液(Ethanol working standards solution)。分別取1μL注入氣相層析儀分析之,以濃度比為X軸,尖峰面積比為Y軸,經迴歸分析求得標準檢量線:Y=a+bX,a、b為常數。
- 中間檢量線查核溶液與檢量線查核標準溶液之製備(Preparation of intermediate calibration verification solution and calibration verification standard solution):利用來源不同之200 proof ethanol配置1~3個中間檢量線查核溶液(Intermediate calibration verification solution),再以1:10比例利用內標準品溶液稀釋中間檢量線查核溶液,以製備檢量線查核標準溶液,即檢量線查核標準溶液含有0.9 g/L之內標準品溶液。檢量線查核標準溶液之濃度應落在標準檢量線之線性範圍(Linear range)。
- 操作條件(Conditions)
- 層析管柱溫度(Column temperature):
- 注入埠溫度(Inlet temperature):175ºC。
- 偵測器溫度(Detector temperature):250ºC。
- 載流氣體流速(Carrier gas flowrate):30 mL / min。
- FID 氣體流速:依製造廠商建議。
- 注入量:1 μL。
- 測定程序(Procedure)
- 將製備而冷藏之檢液與各種標準溶液提高至室溫,並輕輕搖勻。
- 利用乙醇操作標準溶液製備標準檢量線。
- 利用檢量線查核標準溶液查核標準檢量線之品質,若與標準檢量線相對偏差過大,則應考慮重新製備標準檢量線。
- 取乙醇操作標準溶液與檢液各1 μL,分別注入氣相層析儀,就操作標準溶液與檢液所得之尖峰滯留時間(Retention time)比較鑑別之,由標準檢量線計算檢液之濃度比:X=(Y-a)÷b
其中,X為檢液之濃度比=檢液之乙醇濃度÷檢液之內標準品濃度。
Y為檢液之面積比=檢液之乙醇尖峰面積÷檢液之內標準品尖峰面積。
- 計算乙醇濃度(w/v)=檢液之濃度比×檢液之內標準品濃度(μg/mL)×(1 g/106μg)。
- 每隔一定數量之檢液測定後,即穿插利用檢量線查核標準溶液查核標準檢量線之品質。
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