酵素(Enzymes) Facebook Plurk Twitter

        酵素是一群水解酵素(Hydrolytic enzymes)之總稱。自然界中可以分泌酵素之微生物(Microorganism),包括細菌(Bacteria)與真菌(Fungi):

  • 細菌為單細胞生物,能獨立生存與增殖,常用來產製酵素者包括:Clostridium、Cellulomonas、Bacillus、Thermomonospora、Ruminococcus、Bacteriodes、Erwinia、Acetovibrio、MicrobisporaStreptomyces;其中,以Cellulomonas fimiThermomonospora fusca之研究與應用最多。雖然可水解纖維素之細菌,特別是厭氧者,如Clostridium thermocellumBacteroides cellulosolvens所產製之酵素具有較高之活性,但因厭氧菌之生長速率較低,且產製之濃度較低,加上主要為β-glucosidase,故對結晶之纖維素分解能力較低。(Duff and Murray, 1996; Sun and Cheng, 2002)
  • 真菌廣泛存在大自然中,為多細胞所組成,所產製之酵素為細胞外脢,具有易於分離與萃取等優點,加上產製之酵素結構合理,對於纖維素之水解能力較強(齊,2000),因此商業化之酵素製程主要以真菌為主。常見用來產製酵素之真菌包括:Sclerotium rolfsii、Phanerochaete chrysosporium、Trichoderma sp.、Aspergillus niger、SchizophyllumPenicillium variable;其中,以Trichoderma sp. 之研究與應用最多。(Duff and Murray, 1996; Sun and Cheng, 2002)

3.3.2.1 酵素之作用

        從纖維素之結構與其在酵素作用下之分解過程來看,酵素至少包含三種主要之纖維水解脢群:內切型纖維素水解脢(Endo-β-1,4-gulcanase, E.C. 3.2.1.4.)、外切型纖維素水解脢(Exo-β-1,4-gulcanase, E.C. 3.2.1.91)與β-葡萄糖甘脢(β-glucosidase, E.C. 3.2.1.21)(齊,2000;尤,2003;戴,2004):

  • 內切型纖維水解脢又稱為CMCase、Cx cellulose、Carboxymethylcellulase、Endoglucosidase、β-1,4-glucan glucanhydrolase或β-1,4-D-glucan-4-glucanhydrolase,主要用於纖維素分子內部之非結晶區,隨機水解其中之β-1,4-glucosidic linkages,並將長鏈纖維素分子切斷,產生大量具有還原性末端之小分子纖維素。
  • 外切型纖維水解脢又稱為C1、Avicelase、Cellobiohydrolase、Exocellobiohydrolase、β-1,4-D-gulcan cellobiohydrolase或Cellulose-β-1,4-D-gulcan cellobiohydrolase,主要用於分解結晶型之纖維素,由還原端(Reducing ends)或非還原端(Non-reducing ends)將纖維素以纖維雙醣為單位予以分解(Bisaria and Mishra, 1989; Bhat and Bhat, 1997)。
  • β-葡萄糖甘脢又稱為Cellobiase(纖維雙醣脢)、β-1,4-glucosidase或β-1,4-glucohydrolase,主要用以將纖維雙醣或短鏈之纖維寡醣(Cellooligosaccharide)自非還原端起,以葡萄糖為單位予以分解,降低纖維雙醣對於內切型纖維水解脢或外切型纖維水解脢活性之抑制作用。

        透過三者間彼此之協同作用機制(Synergy mechanism),由內切型纖維水解脢首先作用於纖維素之非結晶區,以非特異性(Random)之方法將長鏈之纖維素分子打斷,然後由外切型纖維水解脢作用,經與內切型纖維水解脢之協同作用,使纖維素分子之結晶區,與非結晶區同時水解成纖維雙醣與寡醣,最後由β-glucosidase將纖維雙醣與寡醣水解成葡萄糖,如圖8所示(Ghose, 1976; Bisaria and Ghose, 1981; 齊,2000)。

水解脢協同機制

Adsorption of cellulose enzymes>>>>

水解脢協同機制

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水解脢協同機制

圖8 纖維水解脢作用機制(Béguin, 1987)

         合成酵素之微生物可能是好氧的(Aerobic)或厭氧的(Anarerobic)、中溫的(Mesophilic)或高溫的(Thermophilic),因此不同微生物合成之酵素組成結構亦不同,對纖維素之水解能力當然也就不同,要使用多少劑量之酵素,或如何與其他之酵素搭配組成混合型之酵素,成為纖維乙醇製程重要之課題。

        以Trichoderma reesei產製之酵素為例,其包含四種主要之水解脢(Unsitalo et al., 1991; Szengyel, 2000):外切型纖維水解脢(Cellobiohydrolase)CBH I、CBH II、內切型纖維水解脢(Endoglucosidase)EG I與EG II各約60%、20%、10%與10%。由於所含內切型纖維水解脢之活性較低,加上葡萄糖?脢活性(Cellobiase activity)不高,無法有效分解纖維雙醣,而必須搭配其他之酵素,如β-glucosidase,以避免纖維雙醣之累積對內切型纖維水解脢或外切型纖維水解脢之活性產生抑制作用。

3.3.2.2 酵素之活性

        酵素之活性(Enzyme activity)係以一固定時間內生成物之產量為判斷基準。

        由於酵素系統(Enzymatic system)相當複雜,且酵素在進行纖維水解過程中,涉及酵素與基質間之交互作用,因此酵素之活性可以分成個別酵素與整體酵素之活性。用來測定活性之基質也可分成可溶性基質(Soluble substrate)與不可溶性基質(Insoluble substrate)二類,前者包括Carboxymethyl-cellulose(CMC)與Hydroxyethyl-cellulose(HEC),後者則包括棉(Cotton)、Avicel與Filter paper等;其中,Filter paper自從1984年IUPAC(The International Union of Pure and Applied Chemistry)之生物技術委員會(Commission on Biotechnology)提出測定酵素活性之標準程序後,即成為一標準且價格低廉之基質,而FPA(Filter Paper Assasy)也成為廣泛用來測定酵素活性之標準程序(Xiao et al., 2004),該程序係利用二硝基水楊酸(Dinitrosalicylic acid,DNS)測定基質釋出之葡萄糖濃度。

        依據IUPAC推薦之FPA,酵素之活性可以定義如下:

        FPU/ML

  • FPU(Filter Paper Unit)=平均每分鐘釋出等值於一μmole之葡萄糖。Enzyme amount, which releases 1 μmol of glucose equivalents from Whatman no. 1 filter paper in 1 min
  • A540 sample =The absorbance obtained from the DNS assay for each cellulase assay。
  • A540/mg standard = The standard used for the standard FPA assays。
  • 5.55 μmole/mg = The number of μmoles of glucose in 1 mg。
  • 60 min = The assay incubation time。
  • X mL = The volume of suitably diluted enzyme that was assayed。

        表2為個別酵素與整體酵素活性測定之基質及判斷依據;其中,用來判斷活性之生成物可歸納成三類:基質之某些物理性質改變、降解後某些產物之增加或基質量之減少(Mullings, 1985; Szengyel, 2000)。

        One unit of FPU is defined as the enzyme amount, which releases 1 μmol of glucose equivalents from Whatman no. 1 filter paper in 1 min. One unit of β-glucosidase activity is defined as the enzyme amount, which converts 1 μmol of cellubiose to 2 μmol of glucose in 1 min.

表2 酵素之活性測定(Mullings, 1985)
Enzyme

Substrates

Products

endo-β-1,4-gulcanase, E.C. 3.2.1.4.

1.Carboxymethyl-cellulose
2.Hydroxyethyl-cellulose
3.Amorphous cellulose

Regucing sugar and/or loss in viscosity

exo-β-1,4-gulcanase, E.C. 3.2.1.91

1.Crystalline cellulose (Cotton)
2.Avicel
3.Cellodextrins
4.Heterobiosides

1.Cellobiose
2.Cellobiose
3.Cellobiose
4.4-Nitrophenol/glucose

β-glucosidase, E.C. 3.2.1.21

1. Cellobiose
2.Cellodextrins

1.Glucose
2.Glucose/ Cellodextrins

Cellulase

1.Filter Paper
2.Avicel
3.Hydrocellulose
4.Dyed cellulose
5.Tritiated cellulose
6.Thread

1.Reducing sugar/loss in weight/reduction on absorbance
2.Dye release
3.Scintillation counts
4.Breaking strength

3.3.2.2 酵素活性之測定

        酵素活性之測定(Assay)項目包括:Carboxymethyl cellulose (CMCase)activity、Xylanase activity、β-Glucosidase activity、β-xylosidase activity、α-L-arabinofuranosidase activity與Ferulic acid esterase activity,測定方法如下(Saha et al., 2005b):

  • Carboxymethyl cellulase(CMCase)與 xylanase activities之測定,係於包含1 %(w/v)羧基甲基纖維(carboxymethyl cellulose)與 1%(w/v)麥木聚糖(Oat spelt xylan)之反應混合物0.5 mL中,添加 50 mM之醋酸鹽緩衝劑(Acetate buffer)與適量之稀釋酵素溶液(Dilute enzyme solutions),於pH值5.0、溫度50ºC等條件下,經30分鐘之培養後,以雙硝基柳酸(Dinitrosalicylic acid,DNS)法測出反應物中所含還原醣(Reducing sugars)釋出量,並以每分鐘釋出1 μmol還原醣(Reducing sugars)所需之酵素量作為酵素活性之單位(Unit,U)。
  • β-Glucosidase activity、β-xylosidase activity與α-L-arabinofuranosidase activity之測定,係於包含4 mM p-nitrophenylβ-D-glucoside、2 mM pnitrophenyl β-D-xyloside 與 1 mM p-nitrophenyl-β-L-arabinofuranoside 之反應混合物1.0 mL中,添加50 mM之醋酸鹽緩衝劑與適量之稀釋酵素溶液,於pH值5.0、溫度50ºC等條件下,經30分鐘之培養後,以 1 mL、0.5 M之冰冷碳酸鈉(Na2CO3)終止反應,然後以波長405 nm之光線測量反應物之吸光值,換算對-硝基苯(p-nitrophenyl)之釋出量,並以每分鐘釋出1 μmol p-nitrophenyl所需之酵素量作為酵素活性之單位(Unit,U)。
  • Ferulic acid esterase activity之測定,係於包含0.9 mM之methyl ferulate與0.45% 之Dimethyl sulfoxide(DMSO)之反應混合物0.55 mL中,添加50 mM之醋酸鹽緩衝劑與適量之稀釋酵素溶液,於pH值5.0、溫度50ºC等條件下,經15分鐘之培養後,以 50μl、20%之甲酸(Formic acid)終止反應,經離心分離(14000 rpm,10 min),並以Milli-Q filtered water 稀釋兩倍後,利用高效率液態層析儀(High performance liquid chromatography,HPLC)測定分析阿魏酸(Ferulic acid)含量,並以每分鐘釋出1 μmol阿魏酸所需之酵素量作為酵素活性之單位(Unit,U)。
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