游離甘油與總甘油含量之測定 Facebook Plurk Twitter

        甘油(Glycerin)可分成游離甘油(Free glycerin)與鍵結甘油(Bound glycerin)(包括單酸甘油酯、雙酸甘油酯與三酸甘油酯),合稱總甘油(Total glycerin),是生質柴油製程之副產品與轉酯化反應不完整之殘餘物,其含量高低成為生質柴油品質之指標之一;若其中之游離甘油過高,則儲存及燃油系統可能因甘油分離而衍生其他問題;若總甘油含量過高,則將導致注射器阻塞(Clogged)與注射器之噴嘴、活塞和汽門積垢(Build up)。

         早期對游離甘油與鍵結甘油之測定係分開進行,Plank與Lorbeer(1992)以菜籽油脂肪酸甲酯(Rapeseed oil methyl esters,RME)為對象,利用氣相層析法(Gas chromatography),測定單酸甘油酯(Monoglycerides)、雙酸甘油酯(Diglycerides)與三酸甘油酯(Triglycerides)之含量;該研究將濃度為5 mg/ml、適量之單油酸甘油酯(Monoolein)、雙油酸甘油酯(Diolein)與三油酸甘油酯(Triolein)之己烷(Hexane)溶液,和100μl、濃度為8 mg/ml之三葵酸甘油酯(Tridecanoin or Tricaprin)(Internal standard,內標)之己烷溶液置入螺旋蓋式玻璃瓶(Screw-cap vial),然後於室溫下利用氮氣流移除其中之己烷,接著加入400μl之Pyridine與200μl之N,O-雙三甲基矽氧基三氟乙醯胺(N,O-bistrimethylsilyltrifluoroacetamide,BSTFA),以製備濃度為0.008 mg/ml ~ 0.130 mg/ml不等之標準溶液(Standard solution),經過簡單之搖晃,將玻璃瓶加熱至70℃,並持續15分鐘,再冷卻至室溫,使其中之單油酸甘油酯與雙油酸甘油酯矽化(Silylate),並以氮氣移除瓶內之揮發性物質,然後將製備之樣品溶於甲苯(Toluene)並稀釋至9 ml。在待測樣品之製備上,將100μl之三葵酸甘油酯之己烷溶液(Internal standard,內標)加入置於螺旋蓋式玻璃瓶內之RME(100~110 mg)中,然後於室溫下利用氮氣流移除其中之己烷,接著加入400μl之pyridine與200μl之BSTFA,經過激烈之搖晃混合後,將玻璃瓶加熱至70℃,並持續15分鐘,再冷卻至室溫,使其中之單油酸甘油酯與雙油酸甘油酯矽化,並以氮氣移除瓶內之揮發性物質然後將製備之樣品溶於甲苯(Toluene)並稀釋至9 ml。在氣相層析部分,係使用Carlo Erba MEGA 5300氣相層析儀,配置柱頭注射器(On-column injector)與火焰離子化偵測器(Flame ionization detector;FID),而搭配之管柱規格為10 m ×0.25 mm且內壁塗佈5%苯基聚二甲基矽氧烷(5% phenyl polydimethyl siloxane)、厚度為 0.15 μm 之石英毛細管(Fused silica capillary column),並以2.5 m ×0.53 mm、未塗層之管柱安裝在注射器後再承接分析管柱。層析時,將1μl之樣品於管柱初溫為115℃下注入柱頭注射器,經過1分鐘之恆溫期後,先以30℃/min之升溫速度加熱至180℃,再以7℃/min之升溫速度加熱至230℃,最後以30℃/min之升溫速度加熱至370℃,並停留8分鐘;載氣為氫氣,氣體流量為2.9 ml/min。在待測樣品測定前,先以含有已知量之單油酸甘油酯、雙油酸甘油酯與三油酸甘油酯,和三葵酸甘油酯(Internal standard,內標)之標準溶液,進行四次之氣相層析,測定個別成分之峰面積(Peak area)Ac與三葵酸甘油酯之峰面積Ast,並建立面積比(Ac/Ast)與重量比(Wc/Wst)之校正曲線,結果顯示除了三油酸甘油酯在濃度低於0.05 mg/ml下,呈現非線性外,單油酸甘油酯與雙油酸甘油酯之面積比與重量比在測定之濃度範圍內皆呈現線性關係。此外,該研究也以三種待測樣品為對象,分別針對其中之單油酸甘油酯、雙油酸甘油酯與三油酸甘油酯含量進行五次之測定,以及同一待測樣品,同時其中之單油酸甘油酯、雙油酸甘油酯與三油酸甘油酯含量進行五次之測定,以檢驗研究方法之重複性(Reproducibility),發現本研究所使用之方法重複性很高。

        Mittelbach(1993)以菜籽油脂肪酸甲酯(Rapeseed oil methyl esters,RME)為對象,利用氣相層析法(Gas chromatography),測定游離甘油(Free glycerol)之含量;該研究先將蒸餾過之RME,利用0.1 M之HCl萃取三次,以移除殘餘之甘油,然後以Na2SO4加以乾燥並過濾,成為不含甘油之RME標準溶液,然後將三種已知量之游離甘油溶於二甲基甲醯胺(Dimethylformamide,DMF)中,加入不含甘油之RME標準溶液,以製備之三種不同樣品進行Recovery test;待測游離甘油之四個RME樣品,有二個來自業者,另二個來自實驗室,檢測前先將100~500μl之RME樣品與100 μl之1,4-丁二醇(1,4-Butanediol)(Internal standard,內標)與600~200μl之DMF混合,再加入N,O-雙三甲基矽氧基三氟乙醯胺(N,O-bistrimethylsilyltrifluoroacetamide,BSTFA)使得總量達1 ml,混合溶液經激烈攪拌至少10分鐘,取其2μl進行氣相層析,並將測定結果與酵素反應測定法(Enzymatic determination)加以比較。在氣相層析部分,係使用HP 5890氣相層析儀,配置分流∕不分流之樣品注射系統(Split/ Splitless Injection system),並搭配火焰離子化偵測器(Flame ionization detector;FID)或質譜儀(Mass spectrometry;MS);搭配FID者,係使用60 m ×0.25 mm、膜厚0.25 μm 之石英毛細管(Fused silica capillary column)DB-5,注射器與偵測器之溫度為250℃,管柱之初溫為110℃,升溫速度為5℃/min,最終溫度為250℃,停留時間為15分鐘,注射分流比為1:10,載氣為氦氣;搭配MS者,係使用60 m ×0.25 m、膜厚0.25 μm 之石英毛細管(Fused silica capillary column)DB-5MS,注射器與偵測器之溫度為250℃,管柱之初溫為100℃(停留時間2分鐘),升溫速度為10℃/min,最終溫度為250℃,停留時間為15分鐘,注射分流比為1:30,載氣為氦氣。由於所適用之內標與游離甘油標準溶液之比例為1:1,因此待測樣品之游離甘油濃度為:

        % Free glycerol =(c1×A2×R×100)/(A1×w)

        R=(A1/c1)/(A2/c2)

  • R為Response factor
  • A1為矽化之1,4-丁二醇之峰面積
  • c1為1,4-丁二醇之濃度
  • A2為矽化之游離甘油之峰面積
  • c2為游離甘油之濃度
  • w為待測樣品之重量

        研究結果顯示:氣相層析法對於游離甘油之測定具有相當高之靈敏度,特別是純度較高之蔬菜油甲酯,氣相層析法顯然比酵素反應測定法佳;FID與MS偵測方式中,以MS較佳。

        Plank與Lorbeer(1995)以菜籽油脂肪酸甲酯(Rapeseed oil methyl esters,RME)為對象,發展出利用氣相層析法同步測定游離甘油、單酸、雙酸與三酸甘油酯之程序。該研究將溶於Pyridine,濃度為0.5 mg/ml之甘油、4.0 mg/ml之單油酸甘油酯(Monoolein)、4.0mg/ml之雙油酸甘油酯(Diolein)、5.0 mg/ml之三油酸甘油酯(Triolein)、3.0 mg/ml之1,2,4-丁三醇(1,2,4-Butanetriol)(Internal standard,內標)與8.0 mg/ml之三葵酸甘油酯(Tricaprin)(Internal standard,內標)作為儲備溶液,取定量之單油酸甘油酯、雙油酸甘油酯與三油酸甘油酯儲備溶液,和70μl之1,2,4-丁二醇儲備溶液與100μl之三葵酸甘油酯儲備溶液混合於螺旋蓋式玻璃瓶內,以製作出單油酸甘油酯濃度為0.001 ~ 0.006 mg/ml、雙油酸甘油酯濃度為0.005~0.063 mg/ml、三油酸甘油酯濃度為0.007~0.110 mg/ml、1,2,4-丁三醇濃度為0.022 mg/ml、三葵酸甘油酯濃度為0.090 mg/ml之五種標準溶液(Standard solution)。在待測樣品之製備上,將100μl之三葵酸甘油酯儲備溶液(Internal standard,內標)與70μl之1,2,4-丁三醇儲備溶液(Internal standard,內標)加入置於螺旋蓋式玻璃瓶內之RME(100~110 mg)中,接著加入加入100μl之N-甲基-N-三甲基矽氧基三氟乙醯胺(N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide;MSTFA)與Pyridine(論文未說明加入pyridine與數量),於室溫下持續15分鐘,再將矽化之混合液溶於正庚烷(n-heptane)稀釋至9 ml。在氣相層析部分,係使用Fisons Intruments GC 8000氣相層析儀,配置柱頭注射器(On-column injector)與火焰離子化偵測器(Flame ionization detector;FID),而搭配之管柱規格為10 m ×0.32 mm、膜厚0.1 μm 之石英毛細管(Fused silica capillary column)DB-5,並以2 m ×0.53 mm、未塗層(Uncoated)且去活性(Deactived)之管柱安裝在注射器後再承接分析管柱;層析時,以AS 800自動化取樣器將1μl之樣品於管柱初溫為50℃下注入柱頭注射器,經過1分鐘之恆溫期後,先以15℃/min之升溫速度加熱至180℃,再以7℃/min之升溫速度加熱至230℃,最後彈道式之升溫速度加熱至370℃,並停留10分鐘;載氣為氫氣,氣體流量為3 ml/min(於50℃量測);偵測器之溫度為370℃。該研究將游離甘油與部分甘油酯矽化對於層析效果與結果之影響,並列出可以完全將游離甘油、單酸甘油酯與雙酸甘油酯矽化之四個條件:(1)以N,O-雙三甲基矽氧基三氟乙醯胺(N,O-bistrimethylsilyltrifluoroacetamide,BSTFA)作為矽化劑,加入pyridine或二甲基甲醯胺(Dimethylformamide,DMF),加熱到70℃,並停留15分鐘;(2)以BSTFA加上1%之三甲基氯矽烷(Trimethylchlorosilane,TMS)作為矽化劑,加入pyridine,於室溫下反應15分鐘;(3)以MSTFA作為矽化劑,加入pyridine,於室溫下反應15分鐘;(4)以MSTFA作為矽化劑,,加熱到70℃,並停留15分鐘;本研究係採用其中之第三種條件,使單酸甘油酯之矽化程度達98%,雙酸甘油酯與游離甘油酯達100%,且因加入pyridine作為催化劑,故無須加熱即可完成矽化反應。至於是否完成矽化反應,該研究也提出可以將1,2,4-丁三醇當作指標,若矽化程度不完整,則層析圖上對應於1,2,4-丁三醇之峰將出現出岔且峰高急遽變小。在氣相層析結果之定性分析部分,以三葵酸甘油酯與1,2,4-丁三醇作為內標之RME層析圖顯示,游離甘油與1,2,4-丁三醇在管柱溫度低於100℃時即率先溶出(Elute),且單酸甘油酯、雙酸甘油酯與三酸甘油酯在5%苯基聚二甲基矽氧烷(5% phenyl polydimethyl siloxane)上可依其含碳量清楚地分離;其中,單酸甘油酯中相對於三葵酸甘油酯(tR=19.7 min)之相對滯留時間(Relative retention time,RRT)為0.78之部分,主要為碳數16,但雙鍵數不等之單油酸甘油酯(Monoolein)、單亞麻油酸甘油酯(Monolinolein)與單次麻油酸甘油酯(Monolinolenin),其他可鑑定者還包括單棕櫚油酸甘油酯(Monopalmitin)(CN=16;RRT=0.70)、單硬脂酸甘油酯(Monostearin)(CN=18;RRT=0.79);雙酸甘油酯部分相對於三葵酸甘油酯之相對滯留時間主要從1.09(tR=21.4 min)~1.17(tR=23.0 min),相對之碳數為34、36與38;三酸甘油酯部分相對於三葵酸甘油酯之相對滯留時間主要從1.35(tR=26.6 min)~1.47(tR=29.2 min),相對之碳數為52、54與56。在測定量化分析前之校正部分,將五種不同濃度之標準溶分別進行3次之氣相層析,測定個別成分之峰面積(Peak area)Ac與三葵酸甘油酯之峰面積Ast,並建立面積比(Ac/Ast)與重量比(Wc/Wst)之校正曲線,結果顯示除了三油酸甘油酯在濃度低於5 μg/ml下,呈現非線性外,其餘成分之面積比與重量比在測定之濃度範圍內皆呈現線性關係。在待測物之定量分析部分,該研究先採用同一待測物樣品採連續注射方式進行七次之層析,測定游離甘油、單酸甘油酯、雙酸甘油酯與三酸甘油酯含量,再於同一RME樣品下取樣七次,分別測定游離甘油、單酸甘油酯、雙酸甘油酯與三酸甘油酯含量,以檢驗研究方法之重複性(Reproducibility),發現本研究所使用之方法重複性很高,具有測定結果信賴度高、樣品製備程序簡單與分析時間較短等優點。

        臺灣國家標準中關於B-100生質柴油游離甘油與總甘油含量之測定法(CNS15018),係為以氣相層析法測定生質柴油(甲基酯B-100)之游離甘油(0.005~0.5 mass %)與總甘油(0.05~0.5 mass %)之方法,惟該測定法並不適用於由月桂油類(Lauric oil)(如椰子油、棕櫚仁油等)所得之甲基酯類。該方法先分別取25mg之甘油(Glycerol)、50 mg之單油酸甘油酯(Monoolein)、50 mg之雙油酸甘油酯(Diolein)、50 mg之三油酸甘油酯(Triolein)、25 mg之1,2,4-丁三醇(1,2,4-butanetriol)與80 mg之三葵酸甘油酯(Tricaprin),於定量瓶中以Pyridine分別稀釋到50、10、10、10、25、10 ml,作為校正用標準品,再以微升注射器取出定量之校正用標準品,注入10 ml有墊片(聚四氟乙烯塗層)之螺旋蓋式樣品瓶中,以製備5種不同濃度之標準溶液,再各加入100μl之N-甲基-N-三甲基矽氧基三氟乙醯胺(N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide;MSTFA),旋緊樣品瓶且振搖混合,並在室溫下靜置15~20分鐘,再加入約8ml之正庚烷(n-heptane)且振搖混合,以進行矽化反應;其中,丁三醇與三葵酸甘油酯為測定用之內標準品(簡稱內標)。待測樣品之製備,係直接秤取約100 mg 之生質柴油(甲基酯B- 100)樣品,注入10 ml有墊片之螺旋蓋式樣品瓶中,再使用微升注射器精確地加入各100μl之丁三醇、三葵酸甘油酯與MSTFA,旋緊樣品瓶且振搖混合,並在室溫下靜置15~20分鐘,再加入約8ml之正庚烷且振搖混合。氣相層析方面,使用之氣相層析儀配置火焰離子化偵測器(Flame ionization detector;FID)與冷柱頭注射埠(Cold on-column injector),而搭配之管柱內壁塗佈5%苯基聚二甲基矽氧烷(5% phenyl polydimethyl siloxane),管柱長度10~15 m,內徑為0.32 mm,膜厚為 0.1 μm ,使用溫度上限至少為400℃,並使用一支長2~5m,內徑0.53 mm之高溫保護管柱安裝在注射器後再承接分析管柱;層析條件包括:管柱初溫為50℃,經過1分鐘之恆溫停留後,先以15℃/min之升溫速度加熱至180℃,再以7℃/min之升溫速度加熱至230℃,最後以30℃/min之升溫速度加熱至380℃,並停留10分鐘;載氣為氫氣或氦氣,氣體流量為3 ml/min(於50℃量測);FID溫度為380℃。在待測樣品測定方面,先利用甘油、單油酸甘油酯、雙油酸甘油酯、三油酸甘油酯等四種參比物與丁三醇、三葵酸甘油酯等二種內標製備之標準溶液,於既定之層析條件下,使用自動取樣器,取1μl之標準溶液注入冷柱頭注射埠並開始氣相層析,由獲得之層析圖與波峰積分報告,對每一種參比物計算回應比率rspi與質量比率amti:

        rspi=Ai/As

        amti=Wi/Ws

  • Ai:參比物波峰面積
  • As:內標物波峰面積
  • Wi:參比物質量
  • Ws:內標物質量

        再繪製每一參比物之校正曲線,並計算每一參比物之校正公式:

        Wx/Wis=ax×Ax/Ais+bx

  • Wx:參比物質量
  • Wis:內標物質量
  • Ax:參比物波峰面積
  • Ais:內標物波峰面積
  • ax:校正公式斜率
  • bx:校正公式截距

        校正後,於相同之層析條件下,使用自動取樣器,取1μl之待測樣品注入冷柱頭注射埠並開始氣相層析,先以獲得之層析圖與內標之相對滯留時間(Relative retention time,RRT)比較,進行波峰鑑定,再由波峰積分報告與校正公式計算每一成分之質量。在波峰鑑定方面,游離甘油與1,2,4-丁三醇(內標)率先溶出,且前者相對於後者之相對滯留時間為0.85,單酸甘油酯由4個重疊波峰所組成,相當於單軟脂酸甘油酯(即棕櫚油酸甘油酯,Monopalmitin)、單油酸甘油酯(Monoolein)、單亞麻油酸甘油酯(Monolinolein)、單次麻油酸甘油酯(Monolinolenin)與單硬脂酸甘油酯(Monostearin),相對於三葵酸甘油酯之RRT分別為0.76、0.83~0.86;雙酸甘油酯部分亦依碳數來區分,但由於分子中雙鍵之變化,波峰之基線無法解析,相對於三葵酸甘油酯之RRT為1.05~1.09,相對之碳數為34、36與38;三酸甘油酯部分相對於三葵酸甘油酯之RRT為1.16~1.31,相對之碳數為52、54、56、58。至於每一成分之質量計算,則使用校正公式之斜率與截距來計算:

        甘油百分比G = (ag×Ag/Ais1+bg)×Wis1×100/W

  • G:待測樣品中甘油質量百分比
  • Ag:甘油波峰面積
  • Ais1:內標1之波峰面積
  • Wis1:內標1之質量
  • W:待測樣品質量率
  • ag、bg:校正公式之斜率與截距

        個別甘油酯百分比Gli = (a01×Agli/Ais2+b01)×Wis2×100/W

  • Gli:待測樣品中個別甘油酯質量百分比
  • Agl1:個別甘油酯波峰面積
  • Ais2:內標2之波峰面積
  • Wis2:內標2之質量
  • W:待測樣品質量率
  • a01、b01:校正公式之斜率與截距

        總甘油=游離甘油+鍵結甘油(Bound glycerol)(個別甘油酯脂和)

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