利用酸性或鹼性催化劑進行轉酯化反應，雖有高轉酯率之優點，但也有高耗能、反應後甘油回收與催化劑移除、廢水處理、以及油脂所含水分與游離脂肪酸對於轉酯化反應產生干擾等缺點。然而，在有水（Aqueous）或無水（Nonaqueous）狀態下，採用酵素催化進行轉酯化反應，則有反應條件較溫和、甘油回收容易、產物純度高、分離與純化步驟簡單、不受油脂所含水分與游離脂肪酸之影響等優點，使得利用脂解媒（Lipase）轉酯產製生質柴油逐漸受到重視，但脂解媒催化劑之產製成本遠高於鹼性或酸性催化劑，也是將來能否將脂解媒催化劑廣泛應用於生質柴油製程之關鍵。表7-1為鹼性催化劑與脂解媒催化劑之比較。

表7-1 鹼性催化劑與脂解媒催化劑之比較（Fukuda et al.,2001）
Table 7-1 Comparison between alkali-catalysis and lipase-catalysis methods for biodiesel fuel production（Fukuda et al.,2001）

	Alkali-catalysis process	Lipase-catalysis process
Reaction temperature	60~70°C	30~4O°C
Free fatty acids in raw materials	Saponified products	Methyl esters
Water in raw materials	Interference with the reaction	No influence
Yield of methyl esters	Normal	Higher
Recovery of glycerol	Difficult	Easy
Purification of methyl esters	Repeated washing	None
Production cost of catalyst	Cheap	Relatively expensive

        Mittelbach等人（1990）以石油醚（Petroleum ether）作為溶劑，利用脂解媒Pseudomonas fluorescens與固定化酵素（Immobilized enzymes）Mucor miehei 與Candida sp.對向日葵油進行醇解反應；該研究除了探討這三種不同酯解?與酵素在無水、不同反應溫度與不同醇（甲醇、乙醇與1-丙醇）下之醇解能力外，並以脂解媒Pseudomonas fluorescens，在使用石油醚（Petroleum ether）作為溶劑下，探討使用不同醇之醇解轉換率、有無添加水分之影響與酯化能力。研究結果顯示：沒有添加溶劑下，使用96%之乙醇者，轉換率最高，其次依序為1-丙醇、乙醇與甲醇，而不管有無添加水，醇解之轉換率隨著使用醇之鏈長度增加而增加，除了甲醇之外，有添加水分者，醇解之反應率都比沒有添加水者較高；加入油酸之向日葵油，其中80%之游離脂肪酸可以在5小時內酯化成脂肪酸油酯，顯示脂解媒具有催化游離脂肪酸酯化反應之能力。

        Linko等人（1995）利用Achromobacter sp.、Candida rugosa、Chromobacterium viscosum、Rhizomucor miehei、Pseudomonas fluorescens等脂解媒催化油酸丁酯（Butyl Oleate）與油菜籽油脂肪酸2-乙基己酯（2-ethyl-1-hexyl ester of rapeseed oil fatty acid）之酯化與轉酯化製程。該研究首先以3.27 mM之丁醇、0.7 mM之油酸、1.13 %之脂解媒，於反應溫度40℃、攪拌速度200rpm等條件下，以油酸甲酯之產率高低篩選出四種活性較強之脂解媒Chromobacterium viscosum、Pseudomonas fluorescens、Candida rugosa、Rhizomucor miehei，再以2-Ethyl-1-hexanol（2-乙基己醇），於醇油莫耳比3:1、3%之添加水分與3.3%之脂解媒等條件下，利用篩選出之脂解媒將油菜籽油轉酯化成2-乙基己酯，除Rhizomucor miehei外，其餘脂解媒均能在反應時間24小時獲得96%以上之產酯率；該研究進一步探討脂解媒劑量、添加水分量、醇油莫耳比、反應溫度等因素對酯化反應與轉酯化反應之影響。研究結果顯示：（1）脂解媒劑量越高，初始階段之酯化與轉酯化反應速度越快，隨後之差異即逐漸消失；（2）酯化反應中（醇油莫耳比0.5:1、2:1），使用脂解媒Chromobacterium viscosum者，可以在不添加水分下，於反應時間12小時獲得98%之產酯率，其餘脂解媒在不添加水分下，均無法產酯；（3）酯化反應中（醇油莫耳比0.5:1、2:1），於3.2%之添加水分下，可獲得90%之產酯率者，包括使用Candida rugosa與Pseudomonas fluorescens作為脂解媒者；（4）酯化反應中（醇油莫耳比0.5:1、2:1），使用Rhizomucor miehei作為脂解媒者，只有在14%之添加水分下，才可獲得90%之產酯率；（5）轉酯化反應中（醇油莫耳比2.8:1），使用Candida rugosa作為脂解媒者，最佳之水分添加量為3%；（6）酯化反應中（3.2%之添加水分、0.3%之脂解媒），使用Candida rugosa作為脂解媒者，醇油莫耳比0.5:1~2:1，產酯率均在80%以上；（6）酯化反應中（3.2%之添加水分、0.3%之脂解媒），使用Chromobacterium viscosum作為脂解媒者，產酯率高低受醇油莫耳比之影響較小；（7）以Candida rugosa作為脂解媒之轉酯化反應中（3.3%之脂解媒、3%之添加水分），最佳之醇油莫耳比為2.8:1；（8）以Candida rugosa作為脂解媒之轉酯化反應中（3.3%之脂解媒、3%之添加水分），最佳之反應溫度為55℃。

         Nelson等人（1996）使用五種不同之脂解媒Mucor miehei（Lipozyme IM60）、Candida antarcitca、Geotrichum candidum、Pseudomonas cepacia與Rhizopus delemar，以Primary alcohols（甲醇Methanol、乙醇Ethanol、丙醇Propanol、丁醇Butanol、異丁醇iso-Butyl）或Secondary alcohols（異丙醇iso-Propanol、2丁醇2-Butanol），於反應溫度45℃下，將油菜籽油（Rapeseed oil）、牛油（Tallow）、高FFA含量之油脂（Grease）、黃豆油（Soybean oils）與橄欖油（Olive oil）轉酯化，檢驗脂解媒之轉酯能力，研究結果顯示：（1）於使用Primary alcohols、10%之催化劑劑量、溶劑Hexane與醇油莫耳比3:1等條件下，Mucor miehei之轉酯效率最高；（2）針對牛油（Tallow），於使用Second alcohols、25%之催化劑劑量、溶劑Hexane與醇油莫耳比3:1等條件下，Candida antarctica與Pseudomonas cepacia之轉酯效率較高。該研究也探討不同醇類下，水分、游離脂肪酸含量與有無溶劑對於轉酯之影響，研究結果顯示：（1）使用甲醇時，若反應物中加入水分，則酯之產率將降低；（2）使用甲醇時，FFA含量若超過9%，轉酯反應即受阻，使用乙醇時，FFA含量必須低於22.4%，而FFA含量較高者，則以採用Secondary alcohols較佳；（3）使用甲醇與乙醇時，有添加溶劑者，轉酯率高於無添加溶劑者。

        Basri等人（1997）利用Rhizopus rhizopodiformis製作菌絲脂解媒（Mycelial lipase），於反應溫度37℃下，對Palm oil mid-fraction （PMF）進行水解、酯化與醇解反應，並探討醇類（甲醇與丙醇）、醇油莫耳比與轉換率之關係、溶劑與脂解媒活性之關係，以及分析脂解媒以不同溫度（20℃~70℃），於己烷（Hexane）中培養1小時後之殘餘活性（Residual activity），以探討熱穩定性。研究結果顯示：（1）於反應溫度37℃、醇油莫耳比2:1等條件下，使用甲醇者，歷經10小時後，轉換率為60%，使用丙醇者，轉換率為85%；（2）醇（甲醇或丙醇）油莫耳比以2:1最佳，過量醇反而造成轉換率降低；（3）用於醇解反應之有機溶劑以己烷最佳；（4）脂解媒以低於60℃之溫度，於己烷（Hexane）培養1小時後之殘餘活性仍高於80%，若溫度為70℃，則殘餘活性下降為70%，呈現相當高之熱穩定性；（5）當培養時間延長至24小時，若培養溫度為40℃，則殘餘活性仍可維持在70%以上，若培養溫度為70℃，則殘餘活性降低至0。

        Du等人（2004b）利用固定於Acrylic resin之脂解媒Candida antarcticaB（Novozym 435），將天然黃豆油與精煉黃豆油轉酯化成生質柴油，探討以乙酸甲酯（Methyl actate）或甲醇作為醯基接受者（Acyle acceptor）對於甲酯產率與脂解媒活性之影響。研究結果顯示：（1）使用甲醇者，於反應溫度為40℃、Novozym 435為4%、攪拌速度為150rpm、醇油莫耳比為1:1等條件下，脂解媒之活性即受到影響，甲酯產率僅約30%，使用乙酸甲酯者，於反應溫度為40℃、Novozym 435為30%、攪拌速度為150rpm、醇油莫耳比達12:1等條件下，甲酯產率可達92%；（2）採用三階段添加甲醇、每階段之醇油莫耳比為1:1者，於反應溫度為40℃、Novozym 435為4%、攪拌速度為150rpm、條件下，或採三階段添加乙酸甲酯、每階段之醇油莫耳比為12:1者，於反應溫度為40℃、Novozym 435為30%、攪拌速度為150rpm等條件下，對天然黃豆油與精煉黃豆油進行轉換，使用甲醇者，天然黃豆油與精煉黃豆油之甲酯產率有落差，使用乙酸甲酯者，天然黃豆油與精煉黃豆油之甲酯產率無落差；（3）以三階段添加甲醇或乙酸甲酯者，歷經100個批次循環後，使用乙酸甲酯者明顯不影響Novozym 435之活性；（4）使用乙酸甲酯所產製之副產品（三醋酸甘油，Triacetylglycerol）之經濟價值，比使用甲醇所產製之甘油高。

        Xu等人（2004）利用固定化脂解媒Thermomyces lanuginosus（Lipozyme TL IM），採三階段添加甲醇之方式，於攪拌速度150rpm下，將黃豆油醇解反應成生質柴油，並探討醇油莫耳比與初始反應速度之關係，以及反應溫度（30~50℃）、脂解媒劑量（4~10%）、含水量（0.25~1%）、不同醇（甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇）與甲酯產率之關係；再比較脂解媒於每批次（三階段）醇解反應有無使用異丙醇清洗對於甲酯產率之影響。研究結果顯示：（1）醇油莫耳比為1:1時，初始反應速度可達9g/l-min，若醇油莫耳比超過1.5:1，則初始反應速率急速下降；（2）最佳反應溫度為40℃，若溫度再增加，並無助於甲酯產率之提高；（3）採用三階段、並於第12、24小時各加入1莫耳當量甲醇時，脂解媒劑量越多，最終（反應時間48小時）甲酯產率越高，但因脂解媒劑量差異導致之甲醇產率變化在第三階段較為明顯，因此於前二階段僅添加4%之脂解媒，再於第三階段添加10%之脂解媒，即可獲得98%之甲酯產率；（4）水分含量並無助於提高甲酯產率，即水分含量與醯基之移動（acyle migration）關聯不大，惟水分含量超過1%時，反應速率反而出現些微下降；（5）五種醇類中，以甲醇最佳，異丙醇最差；（6）於反應溫度為40℃，脂解媒劑量為10%，採三階段且分別於第1、3小時各添加1莫耳當量之甲醇、每批次反應時間為12小時等條件下，每批次反應後以異丙醇清洗脂解媒，將有助於甘油之移除，使脂解媒在歷經15次批次循環後，仍可維持94%之甲酯產率。

        Deng等人（2005）利用Lipozyme TL IM（Thermomyces lanuginose lipase；TLL-1）、Lipozyme RM IM（Rhizomucor miehei）、Novozyme 435（Candida Antarctica lipase B；CAL）、Lipase LA201（Thermomyces lanuginose lipase，TLL-2）、Lipase PS-C（Pseudomonas cepacia lipase；PCL）、Lipase AK-C（Pseudomonas fluorescens lipase，PFL）等六種固定化脂解媒，搭配甲醇、99%之乙醇、96%之乙醇、1-丙醇、2-丙醇、丁醇與異丁醇等七種醇，於反應溫度為40℃、反應時間為24小時等條件下，採四階段、並分別於第2、4、8小時各加入四分之三莫耳當量之甲醇，對向日葵油進行醇解反應，分析不同固定化脂解媒與醇搭配下之甲酯產率。研究結果顯示：（1）Novozyme 435為較佳之固定化脂解媒，與甲醇、99%之乙醇、1-丙醇搭配下，甲酯產率超過90%；（2）除了與Novozyme 435搭配外，96%之乙醇為較佳之醇；（3）除了Novozyme 435外，水含量越高，甲酯產率越高。

        Du等人（2005）利用固定於Silica gel之脂解媒Thermomyces lanuginosus（Lipozyme TL），採三階段添加甲醇、每階段醇油莫耳比為1:1之方式，於反應溫度40℃下，對黃豆油進行轉酯化反應，該研究指出過量之醇劑量，將導致脂解媒失活，且因Lipozyme TL 具有強烈之1,3-positional specificity，理論上之生質柴油產率僅有66%，然而要能讓產率超過90%，應與醯基移動（acyle migration）能否在反應過程中發生有關，因此該研究以不同劑量之Lipozyme TL（2~10%）探討脂肪酸甲酯（FAME）之產率，發現劑量越高者，產率越高，使用10%之Lipozyme TL，可獲得92%之產率，使用4%之Lipozyme TL，則僅可獲得 65%之產率，顯示醯基移動與脂解媒之劑量有關，而後該研究進一步探討脂解媒固定與否、水含量與添加Silica gel對轉酯化反應之影響。研究結果顯示：（1）使用未固定之脂解媒，即便其活性與10%之Lipozyme TL相同，但歷經72小時也僅能獲得63%之產率，再以Thin layer chromatograph進行產物分析，發現使用固定化脂解媒者，產物內除了1,2-(2,3-) Diglycerides外，也出現1,3-Diglycerides，但使用未固定之脂解媒者，則無法偵測出1,3-Diglycerides，表示固定化脂解媒中確有某些物質對醯基移動發生作用；（2）水含量於固定化脂解媒轉酯化反應過程中，並無法加速醯基移動，且對轉酯反應有副作用；（3）於4%之Lipozyme TL中加入6%之Silica gel可獲得之產率與使用4%之Lipozyme TL者相近。

        Noureddini等人（2005）以黃豆油作料源，於反應溫度為35℃、攪拌速度為700 rpm、250 mg之脂解媒、3g之甲醇、10g之油、反應時間為1小時等條件下，比較Penicillium roqueforti、Pseudomonas sp.（AK）、Pseudomonas sp.（PS）、Mucor sp.、Aspergillus niger、Rhizopus oryzae、Penicillium camemberittii、Rhizopus niveus、Candida rugosa等九種脂解媒之轉酯能力，篩選出其中活性最強之Pseudomonas sp.（PS），並將其固定在Sol-gel polymer matrix（由水解後之tetramethoxysilane 與iso-butyltrimethoxysilane經聚合化反應所生成）作為該研究採用之固定化脂解媒，而後就脂解媒劑量（0~700mg）、水含量（0.05~2.0g）、醇油莫耳比（甲醇2.7~13.7、乙醇5.7~26.7）、脂解媒熱穩定性、溫度（25~60℃）等因素對於轉酯化反應之影響加以探討，找出以Pseudomonas sp.（PS）搭配甲醇或乙醇之最佳反應條件，再以最佳之反應條件對黃豆油進行轉酯，並檢驗脂解媒之穩定性與重複使用能力。研究結果顯示：（1）使用甲醇時之最佳反應條件為脂解媒劑量475mg、含水量0.5g、醇油莫耳比7.5:1、反應溫度35℃，使用乙醇時之最佳反應條件為脂解媒劑量475mg、含水量0.3g、醇油莫耳比15.2:1、反應溫度35℃；（2）反應前，於35℃下，將脂解媒在黃豆油中培養72小時，並沒有影響其轉酯能力，顯示固定化脂解媒Pseudomonas sp.（PS）確有相當之熱穩定性；（3）於最佳之反應條件下，使用甲醇可獲得65mol%之產酯率，使用乙醇可獲得63mol%之產酯率；（4）歷經11次循環反應，使用乙醇者，轉酯率下降5mol%，但使用甲醇者，下降幅度則較大。

        Oda等人（2005分別採用起舉式生物反應器（Air-lift bioreactor）與震盪培養瓶（Shake-flake）將脂解媒Rhizopus oryzae cell固定於Biomass support particles（BSPs），然後再以Glutaraldehyde（GA）處理，成為Whole-cell biocatalyst，對植物油進行甲醇解反應；該研究先於反應溫度為30℃、攪拌速度為150 oscillations/min、醇油莫耳比為1:1、含水量為wt.15%等條件下，探討甲醇解活性（以甲酯產率定義之）與Rhizopus oryzae cell固定於BSPs之重量，發現以起舉式生物反應器固定化脂解媒Rhizopus oryzae cell之甲醇解活性高於以震盪培養瓶者，而於BSPs上固定Rhizopus oryzae cell所需之時間，使用起舉式生物反應器者需44小時，使用震盪培養瓶者則需96小時，若再進一步從其可重複性使用之耐性加以比較，發現使用起舉式生物反應器者，在歷經五次循環反應後，甲酯產率仍可維持在80%，但使用震盪培養瓶者，則降低到60%；因此該研究以起舉式生物反應器固定化脂解媒為基礎，探討水含量（0~15wt.%）對重複甲醇解反應之影響、於不同含水量與多次循環反應下，分析甲醇解反應過程之中間產物、探討水含量與脂解媒劑量對於醯基移動（acyle migration）之影響。研究結果顯示：（1）不含水者，第一次循環反應之甲酯產率為75 wt. %，第二次循環反應則降至30 wt. %，而含水量5~15wt.%者，下降之幅度則較小，其中以含水量5wt.%者，下降幅度最小；（2）含水量越高者，產物中之游離脂肪酸（FFA）越高，單酸甘油酯（MG）越低；（3）不論含水量高低，首次循環反應產物中之單酸甘油酯、雙酸甘油酯（DG）與三酸甘油酯（TG）都很低，但隨著循環反應次數之增加而增加，其中以2-MGs、1,2(2,3)-DGs之增加較明顯，1,3-DGs與1(3)-MGs則較不明顯；（4）2-MGs、1,2(2,3)-DGs之含量，隨水含量與反應時間之增加而降低，顯示脂解媒Rhizopus oryzae導致甘油酯之醯基移動由sn-2移到sn-1(3)。

         Salis等人（2005）先以三油酸甘油酯（Triolein）作為料源，於不使用溶劑、反應溫度為40℃、醇油莫耳比為3:1、反應時間為50小時等條件下，以1-丁醇分別與Novozym 435（Candida antarctica）、Lipozyme RMIM（Rhizomucor miehei）、PS-C（Pseudomonas cepacia）、PS-D（Pseudomonas cepacia）等四種固定化脂解媒進行醇解反應，找出其中活性最強之PS-D作為該研究採用之固定化脂解媒，並探討溫度（20~70℃）、水活性（Water activity）、醇油莫耳比（3:1~12:1）、醇種類（Methanol 、Ethanol、1-Propanol、1-Butanol、2-Butanol、iso-Butanol、iso-Amyl alcohol）等對醇解反應之影響，再以探討中所得到之最佳條件為基礎，以合成之Fusel oil-like alcohol（由5.6%之1-Propanol、5.6%之2-Methyl-1-Propanol、1.3%之1-Butanol、27.6%之2-Butanol、64.4%之iso-Amyl alcohol合成）與PS-D，對三油酸甘油酯進行轉酯反應。研究結果顯示：（1）使用1-丁醇，於醇油耳比3:1下，反應時間越長（1~6小時）轉酯率越高，最佳之反應溫度為40℃；（2）水活性aw=0.4~0.6間，PS-D之活性最強；（3）於使用1-丁醇、PS-D、水活性aw=0.432、反應溫度為40℃等條件下，最佳之醇油莫耳比為3:1或6:1，在反應時間4小時後，即達到100%之轉酯率；（4）於使用PS-D、水活性aw=0.432、反應溫度為40℃等條件下，除了甲醇與2-丁醇外，其他之醇都可獲得相當高之轉酯率（以1-丁醇最佳），其中，甲醇因與油脂不能相混合，2-丁醇則因脂解媒之Regio-specificity與Stereo-specificity等因素，造成轉酯率偏低；（5）於水活性aw=0.432、反應溫度為40℃等條件下，以合成之Fusel oil-like alcohol與PS-D對三油酸甘油酯轉酯，可於反應時間12小時後，即達到100%之轉酯率。